基礎醫學(xué)研究所余佳團隊發(fā)現RNA可變剪接在造血干細胞發(fā)生中的表達及功能

2022年1月7日，中國醫學(xué)科學(xué)院基礎醫學(xué)研究所余佳教授團隊在Science Advances發(fā)表了“Single-cell architecture and functional requirement of alternative splicing during hematopoietic stem cell formation”的論文。該研究首次在單細胞水平系統性描繪了小鼠HSC發(fā)育全程的RNA剪接圖譜，并對EHT過(guò)程的關(guān)鍵可變剪接（alternative splicing, AS）事件及其上游調控因素進(jìn)行探究，鑒定出Srsf2通過(guò)調控造血細胞特異性AS事件促進(jìn)HSC發(fā)生的新機制。

精確解析不同類(lèi)型組織干細胞的發(fā)育過(guò)程將為再生醫學(xué)帶來(lái)新的曙光。近年來(lái)，迫切的臨床需求加之體外再生效率低下，使得造血干細胞（hematopoietic stem cell, HSC）的高效獲取成為最受關(guān)注的研究領(lǐng)域之一。HSC發(fā)育是一個(gè)錯綜復雜的動(dòng)態(tài)調控網(wǎng)絡(luò )，關(guān)于其胚胎起源的時(shí)序特征、發(fā)生機制等仍存在諸多未知。精確解析HSC發(fā)生的調控規律，是指導體外功能性HSC再生的先決條件。基于單細胞全長(cháng)轉錄組的技術(shù)，該研究構建了基于轉錄本層面的基因表達圖譜，鑒定出一系列HEC、T1 pre-HSC階段特異性表達的轉錄本。值得注意的是，某些基因僅僅呈現某個(gè)特殊轉錄本的造血階段特異性表達，而這種表達差異在基因層面由于其他轉錄本干擾被掩蓋（圖1）。提示目前轉錄組研究以“基因”為中心的分析模式存在不足，而將同一基因的不同轉錄本納入分析范疇，將為深入理解和剖析基因功能提供更多參考和依據。

圖1. HSC發(fā)育全程的單細胞轉錄本圖譜

在上述發(fā)現基礎上，作者進(jìn)一步從AS角度解析T1 pre-HSC所呈現的最為顯著(zhù)的轉錄本多樣性。在整個(gè)EHT過(guò)程中，共鑒定出超過(guò)一萬(wàn)多個(gè)AS事件，并且AS事件的發(fā)生頻率在T1 pre-HSC階段達到峰值，與其顯著(zhù)的轉錄本多樣性吻合。借助單細胞測序的優(yōu)勢，作者在隨后分析中引入“modality”的概念，即：根據AS事件在同一細胞群體內的分布情況將其分為5種模式。作者有趣地發(fā)現，伴隨細胞命運從內皮向造血的逐步轉換，“included”類(lèi)型的AS事件也呈現分階段產(chǎn)生的特征，包括分別鑒定出的979個(gè)HEC階段開(kāi)始出現的“included”AS事件，以及822個(gè)T1 pre-HSC階段開(kāi)始出現“included”AS事件。由于上述AS事件均特異性發(fā)生在具備造血潛能的細胞群體中，我們將其統稱(chēng)為造血細胞特異性“included”AS事件，而這些事件很可能為HSC產(chǎn)生所必需（圖2）。

圖2. EHT過(guò)程中造血細胞特異性“included”AS事件的鑒定

為了探究調控這些AS事件的上游因素，作者通過(guò)對其旁側序列的RNA motif分析，預測出若干剪接因子結合位點(diǎn)，并結合候選剪接因子在EHT過(guò)程的表達變化，選定Srsf2為后續研究對象。作者隨后構建了條敲小鼠模型，發(fā)現內皮細胞Srsf2缺失導致主動(dòng)脈內造血簇數量的顯著(zhù)減少，HEC比例也顯著(zhù)降低。繼而，作者通過(guò)AGM區的組織塊培養及后續移植發(fā)現，Srsf2突變胚胎的嵌合率顯著(zhù)降低，同時(shí)伴隨髓系、B細胞和T細胞的重建缺陷。最后，作者對Srsf2缺失的HEC群體進(jìn)行少量細胞RNA-seq分析，結果顯示，Srsf2缺失造成HEC細胞AS譜的整體改變，其中不乏調控HSC發(fā)生的關(guān)鍵轉錄因子，如：Runx1和Myb等。因此，Srsf2可以通過(guò)改變EHT過(guò)程中關(guān)鍵基因的剪接模式，在HSC發(fā)生中發(fā)揮不可或缺的作用。

該研究拓展了我們對于HSC發(fā)育過(guò)程轉錄組認識的深度和廣度，使我們從RNA可變剪接角度重新審視EHT過(guò)程，并證明可變剪接可通過(guò)改變基因特定轉錄本的表達發(fā)揮調控細胞命運的重要作用。

本研究工作得到中國醫學(xué)科學(xué)院醫學(xué)科學(xué)創(chuàng )新基金（Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences）（項目編號：2021-I2M-1-019和2021-I2M-1-040）、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（項目編號：2019YFA0801800,2019YFA0111700,2017YFA0103401,2016YFA0100601, 2020YFA0112402）等項目的資助。中國醫學(xué)科學(xué)院基礎醫學(xué)研究所余佳教授、暨南大學(xué)蘭雨研究員、解放軍總醫院第五醫學(xué)中心劉兵研究員、南方醫科大學(xué)王棟教授為本文的共同通訊作者。中國醫學(xué)科學(xué)院基礎醫學(xué)研究所王芳教授、任悅博士，南方醫科大學(xué)譚普文博士，軍事醫學(xué)研究院張鵬程博士為本文的共同第一作者。

論文鏈接:

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abg5369

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